新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.41.003

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (41): 7199-7204.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.41.003

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新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定

程浩¹，张延芳¹，许巍²

¹广东医学院信息工程学院物理教研室，广东省东莞市 523808；²广西梧州制药(集团)股份有限公司，广西壮族自治区梧州市 543002

收稿日期:2013-04-05 修回日期:2013-07-16 出版日期:2013-10-08 发布日期:2013-11-01
通讯作者: 张延芳，博士，副教授，广东医学院信息工程学院物理教研室，广东省广州市 523808 zjzyf2006@163.com
作者简介:程浩★，男，1986年生，山东省临沂市人，汉族，2013年广东医学院毕业，硕士，主要从事骨质疏松方面的研究。 chenghao712@163.com
基金资助:
东莞市医疗卫生重点课题(2012105102006)*；东莞市医疗卫生一般课题(201210515200001)*

Primary culture and identification of neonatal rat osteoblasts

Cheng Hao¹, Zhang Yan-fang¹, Xu Wei²

¹Department of Physics, School of Information Engineering, Guangdong Medical College, Guangzhou 523808, Guangdong Province, China; ²Guangxi Wuzhou Pharmaceutical (Group) Co., Ltd., Wuzhou 543002, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2013-04-05 Revised:2013-07-16 Online:2013-10-08 Published:2013-11-01
Contact: Zhang Yan-fang, M.D., Associate chief physician, Department of Physics, School of Information Engineering, Guangdong Medical College, Guangzhou 523808, Guangdong Province, China zjzyf2006@163.com
About author:Cheng Hao★, Master, Department of Physics, School of Information Engineering, Guangdong Medical College, Guangzhou 523808, Guangdong Province, China chenghao712@163.com
Supported by:
Key Medical and Health Project of Dongguan, No. 2012105102006*; General Medical and Health Project of Dongguan Ctiy, No. 201210515200001*

摘要/Abstract

摘要：

背景：组织工程需要大量的种子细胞，成骨细胞是骨组织工程的重要种子细胞之一。但是成骨细胞培养难度大，不同培养方法得到的成骨细胞数量、纯度、增殖及分化活性各有区别。
目的：验证及比较成骨细胞原代培养常用的3种方法，探索一种操作简便，既经济又高效的原代培养成骨细胞的方法，为进一步的实验研究奠定基础。
方法：取新出生72 h 内SD大鼠乳鼠颅骨，以胶原酶消化法、分段胶原酶消化法及组织块法分离成骨细胞，进行细胞形态观察、细胞化学染色、CCK-8法绘制生长曲线及锥虫蓝排斥法计数活细胞率。
结果与结论：分离培养的成骨细胞增殖良好，具备典型成骨细胞特性，细胞化学染色结果明显。胶原酶消化法比分段胶原酶消化法提取的成骨细胞数量多，细胞存活率高(P < 0.05)；且比分段胶原酶消化法操作简单，耗时短。组织块法操作最为简单，对细胞损伤较小，但是细胞数量低、耗时长，很难用于大规模成骨细胞培养。胶原酶消化法是一种方便、高效、理想的原代成骨细胞分离培养方法。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, 成骨细胞, 原代培养, 胶原酶消化法, 组织块法, 胶原酶, 成骨细胞鉴定

Abstract:

BACKGROUND: Tissue engineering requires a lot of seed cells. Osteoblasts have become important seed cells in bone tissue engineering. However, it is difficult to culture the osteoblasts, and cell number, purity, proliferation and differentiation activity are different obtained by different culture methods.
OBJECTIVE: To identify and compare three common primary osteoblat culture methods, and to explore a method for the primary culture of osteoblasts which is easy to operate, economical and effective, in order to provide basis for the further experimental research.
METHODS: Calvarias were dissected from newborn Sprague Dawley rats in 72 hours, and osteoblasts were isolated with collagenase digestion method, sequential digestion method and bone tissue method respectively. The morphological observation and cytochemical staining were performed, the growth curve of the cells was drawn with Cell Counting Kit-8 method, and the rate of living osteobalsts was counted with trypan blue staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The proliferation of the insolated and cultured osteoblasts was well with typical characteristics of osteoblasts, cytochemical staining results were positive. Compared with the sequential collagenase digestion method, the collagenase digestion method presented higher production of osteoblasts and higher cell survival rate (P < 0.05), and the collagenase digestion method was easier than the sequential collagenase digestion method and cost less than sequential collagenase digestion method. Bone tissue method was the easiest method with less damage to cells, but bone tissue method presented lower production of osteoblasts and cost much more time, which cannot be used in large-scale osteoblast culture. The collagenase digestion method is a simple, efficient and ideal method for isolation and culture of primary osteoblasts.

Key words: rats, skull, esteoblasts, cell culture techniques, cell proliferation, growth charts

中图分类号:

R318

程浩，张延芳，许巍. 新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(41): 7199-7204.

Cheng Hao, Zhang Yan-fang, Xu Wei. Primary culture and identification of neonatal rat osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(41): 7199-7204.

图/表（结果） 5

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引言

材料方法

设计：细胞形态学与生物学特性实验。

时间及地点：2010年7月至2011年2月在广东医学院基础医学院科技平台实验室完成。

材料：

实验动物：取新生72 h内SD大鼠若干只，不计体质量、不分雌雄，由广东医学院动物实验中心提供，实验动物许可证号：SCXK(粤)2008-0008。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定实验的试剂与仪器：

实验方法：

组织块法取颅骨成骨细胞：将新生SD大鼠(72 h内)5只浸泡在体积分数75%乙醇烧杯中3-5 min，无菌条件下剪开头部皮肤，取出颅骨，放入盛有D-Hanks(含青霉素3×10⁵ U/L、链霉素3×10⁵U/L)缓冲液的培养皿中，刮去骨膜及骨缝间结缔组织，剪成约1 mm×1 mm大小的骨片，以D-Hanks液洗3次，加入等量0.25%胰蛋白酶消化10 min，加入含体积分数10%新生小牛血清的DMEM培养液终止消化，然后将碎骨片均匀接种于培养瓶中，翻转培养瓶置于培养箱中，3 h后转正培养瓶。21 d后换液，细胞长满瓶后传代培养。

胶原酶消化法：取新生SD大鼠(72 h内)5只，即SD乳鼠浸泡于体积分数75%乙醇的烧杯中消毒3-5 min, 无菌条件下剪开头部皮肤，取出颅骨，放入盛有D-Hanks(含青霉素3×10⁵ U/L、链霉素3×10⁵U/L)缓冲液的培养皿中，刮去骨膜及骨缝间结缔组织，剪成约 0.5 mm×0.5 mm大小的骨片，以D-Hanks液洗3次，加入等量0.25%胰蛋白酶消化10 min，弃掉胰酶，加入消化液10只/2.5 mL(Ⅰ型胶原酶5 mg、透明质酸酶 2.5 mg，DMEM培养液配制)，37 ℃恒温条件消化 20 min，每5 min摇匀1次，让消化液与骨片充分接触。吸走弃掉消化液，再加入2.5 mL消化液在37 ℃恒温条件下消化90 min。用等量含血清培养液终止消化，将消化液转移至离心管中。用培养液将骨块洗3次，吹打骨块，同样转移液体到离心管中。离心1 000 r/min，6 min沉淀细胞，含血清培养液重悬细胞，放入体积分数5%CO₂ 饱和湿度条件下于恒温培养箱37 ℃培养。差速贴壁法纯化成骨细胞，待细胞长满瓶底传代培养。

分段胶原酶消化法：取新生大鼠(72 h内)5只，即SD乳鼠浸泡于体积分数75%乙醇的烧杯中消毒3-5 min，无菌条件下剪开头部皮肤，取出颅骨，放入盛有D-Hanks(含青霉素3×10⁵ U/L、链霉素3×10⁵U/L)缓冲液的培养皿中，刮去骨膜及骨缝间结缔组织，剪成约 0.5 mm×0.5 mm大小的骨片，以D-Hanks液洗3次，加入等量0.25%胰蛋白酶消化10 min，弃掉胰酶，加入消化液10只/2.5 mL(Ⅰ型胶原酶5 mg、透明质酸酶 2.5 mg，DMEM配制)，37 ℃恒温条件消化20 min，每5 min摇匀1次，让消化液与骨片充分接触。吸走弃掉消化液。再加入2.5 mL消化液。37 ℃恒温条件消化20 min，收集细胞悬液，离心1 000 r/min，5 min沉淀细胞，将上清转移至骨片继续消化重复6个循环。每次沉淀的细胞都要用含血清培养液重悬。最后将所有细胞悬液收集离心，含血清培养液重悬，放入体积分数5%CO₂饱和湿度条件下于恒温培养箱37 ℃培养，差速贴壁法纯化成骨细胞，待细胞长满瓶底传代培养。

MGG染色：纯化后的细胞以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于盖玻片上。待细胞融合80%后，吸弃培养液，PBS洗3次，体积分数10%中性甲醛固定20 min。MGG染液染15 min，自来水冲洗，空气干燥，封固。

碱性磷酸酶(ALP)染色：纯化后的细胞以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于盖玻片上。待细胞融合80%后，吸弃培养液，PBS洗3次，体积分数10%中性甲醛固定20 min。染色操作参照碱性磷酸酶染色试剂盒(南京建成科技有限公司)说明书。

茜素红染色：纯化后的细胞以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于盖玻片上。培养21 d后，镜下可见不透明区域。吸弃培养液，PBS洗3次，体积分数10%中性甲醛固定 20 min。0.1%茜素红-Tris-Hcl(pH 8.3)染色30 min，自来水冲洗，空气干燥，中性树胶封固。

绘制生长曲线：取培养第3代成骨细胞，用含有0.02%四乙酸乙二胺(EDTA)的0.25%胰酶消化离心，含有血清的DMEM培养液重悬细胞。以3 000个/孔接种于96孔板，设置3个复孔。用CCK-8试剂盒从第1天开始，连续测7 d。

细胞活力的锥虫蓝染色测定：制备单细胞悬液，稀释至10⁹ L^-1。细胞悬液与0.4%锥虫蓝溶液以9∶1混匀， 3 min内血球计数板计数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成明显蓝色，或活细胞拒染呈无色透明状。

主要观察指标：比较3种方法培养细胞形态、细胞化学染色以及CCK-8法绘制生长曲线及锥虫蓝排斥法计数活细胞率。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 17.0统计软件进行统计处理，计量数据以x(_)±s表示，并对其数据进行检验。

讨论

成骨细胞是骨代谢过程中的重要执行细胞^[7]。对于成骨细胞研究是探讨骨疾病发病机制与原理的重要手段同时也是骨组织工程研究的关键^[8-9]。目前提取成骨细胞的主要来源是骨膜和松质骨，培养方法有酶消化法和组织贴块法。

体外分离培养成骨细胞是研究其生物学特性与功能调节的重要工具^[10-11]。成骨细胞的培养至今大约有40余年的历史，最初是Peck等^[12]于1964年使用胶原酶消化首次成功分离新生大鼠成骨细胞，1975年Wong等^[13]采用多次胶原酶消化法纯化得到的成骨细胞。20世纪80年代，Robey等^[14]低钙培养骨片获得人成骨细胞。有研究证实骨组织中各类细胞耐受消化酶能力依次为：成纤维细胞<破骨细胞<骨祖细胞<成骨细胞^[15]。

常规组织块法要求骨片贴壁，利用成骨细胞的爬行性来获得成骨细胞。首先必须对骨片进行预处理，使骨片包被组织包浆。但是这些包浆实际是一些为剥离完全的骨膜等结缔组织，促使骨片贴壁的同时同样阻滞了成骨细胞的大量爬出^[16]。张涌泉等^[17]利用漂浮组织块法获得了高纯度兔成骨细胞，但是需要多次机械剥离与消化。为了获得下颌骨成骨细胞，贴壁法同样被应用^[18-19]。陈洁等^[20]利用骨组织块法和酶消化法联合培养人成骨细胞取得不错的效果，但是贴壁法的耗时长，细胞量少的缺点非常明显。为了研究骨形成的机制，探讨骨疾病的细胞生物及分子机制，Clarke等^[21]分离获得人成骨细胞获得很大成功，虽然取材来源于人更能反映人的成骨细胞特性，但是人成骨细胞来源少，与患者沟通难同样是一个不争的事实。实验所有酶消化法，都是先采用胰蛋白酶消化，将先消化下来的混杂细胞倒掉，然后再使用胶原酶法进行消化，可以进一步纯化成骨细胞。胶原酶与透明质酸酶的作用相对温和，Ⅰ型胶原酶是Ⅰ、Ⅲ型胶原水解的关键酶^[22]，而骨组织的基质有机成分90%是由Ⅰ型胶原构成。透明质酸是细胞外基质中限制水分及其它细胞外物质扩散作用的成分，透明质酸酶可以有效降解由于透明酸引起的骨细胞运动、增殖和凝聚^[23]。吴曼等^[24]研究了不同浓度乳铁蛋白(0，0.1，1，10，100，1 000 mg/L)对体外培养原代大鼠成骨细胞增生与分化的影响，观察乳铁蛋白是否呈时间剂量依赖性促进成骨细胞的增生与分化？实验结果显示除0.1 mg/L组外，各时段不同乳铁蛋白干预均可促进成骨细胞增生，但10，100 mg/L 乳铁蛋白干预第7天时细胞增生情况与未干预市无显著性意义。实验证明了乳铁蛋白能促进大鼠成骨细胞增生与分化，并在一定时间和浓度范围内呈时间剂量依赖性。

成骨细胞包绕在硬组织中，致使处理困难，可采用骨组织块法、酶消化法、酶消化法、骨膜组织块法、骨髓培养法以及薄层骨片经EDTA处理并经胶原酶消化，均可培养出成骨细胞^[25]。体外培养的成骨细胞保持有骨组织细胞的某些特征。但不同方法培养的成骨细胞形态是不同的^[26]。成骨细胞的鉴定是确定得到的原代细胞是否是成骨细胞及细胞纯度，在形态学上通过倒置显微镜观察活细胞、MGG染色等方法，观察到与文献报道一致^[27]。成骨细胞在不同分化时期各基因表达调控的规律也不同^[28-29]。碱性磷酸酶及矿化结节是成骨细胞分化的标记物^[30-31]。碱性磷酸酶染色实验得到的大量细胞出现阳性反应，细胞胞膜及胞浆内颗粒染色呈棕色或者咖啡色颗粒。采用茜素红染色，可见橘红色矿化结节。综合形态、碱性磷酸酶染色及矿化功能特征鉴定所培养的原代细胞为成骨细胞^[32]。

综上所述，SD大鼠的胶原酶消化法，其标本来源丰富易得，操作简便，获得成骨细胞纯度高、数量大；有效克服组织块法获得细胞量少，培养时间过长的缺点，同样弥补分段胶原酶法的操作程序繁杂，耗时长，且夹杂太多散碎骨组织的不足，是进行成骨细胞体外培养甚为理想的方法。

新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定

Primary culture and identification of neonatal rat osteoblasts

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